| 초록 |
□ 연구개요 본 연구과제에서는 유전자 대체(gene replacement) 방법과 인간의 배아줄기세포/유도만능줄기세포로부터 유도한 인간의 신경세포를 이용하여 CFC증후군과 관련된 각각의 BRaf 유전자 돌연변이가 시냅스 전달과 가소성, 그리고 동물행동에 미치는 영향을 각각 분석하여 인간의 신경세포에서 Ras-BRaf-MAPK 신호전달경로의 이상이 어떻게 넓은 범위의 신경정신질환을 유발하는지 기전을 밝히고자 하였음. 또한 BRaf 유전자 돌연변이에 의한 시냅스전달, 학습과 기억의 이상이 MEK 저해제에 의해 회복되는지 환자유래 신경세포와 동물모델을 활용해 연구함으로써 Ras-MAPK 신호전달 경로와 관련된 여러 신경정신질환에 대한 새로운 치료법 개발에도 기여하고자 하였음. □ 연구 목표대비 연구결과 : ESC 유래 iN cell을 이용한 BRaf 돌연변이에 의한 시냅스 전달 특성 연구 - 인간의 배아줄기세포(ESC) 유래 유도신경세포(induced neuronal (iN) cell)를 분화 배양하여 CFC증후군 관련 BRaf 돌연변이 대체에 의한 Ras-MAPK 신호전달경로 활성화/억제 연구를 완료함. - ESC 유래 iN cell에서 CFC증후군 관련 BRaf 돌연변이 대체에 의해 기본적인 전기적 특성, 시냅스전달 특성이 변화하는지 patch-clamp recording으로 확인한 결과, 기본적인 전기적 특성은 변하지 않고, 시냅스전달 특성 중 mEPSC 빈도(frequency)는 변화가 없었지만, 크기(amplitude)는 BRaf 돌연변이들 발현에 의해 감소하는 것을 확인함. : CFC증후군 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSC) 제작 및 검증 - CFC증후군 환자 유래 유도만능줄기세포(CFC2, 7)를 도입하여 CF-1 feeder cell 상에서 배양함. - CFC증후군 환자 유래 iPSC의 줄기세포 특성 검증함. : CFC증후군 환자유래 iN cell 제작 및 시냅스전달 형질 연구 - CFC증후군 환자 유래 iPSC들, BRaf#2, #7을 Neurogenin 2를 발현시키는 방법으로 흥분성, 전두엽성 신경세포로 분화 유도하여 기본적인 전기적 특징들을 조사한 결과 대부분 대조군과 차이가 없었지만, BRaf iN cell들에서 Na<sup>+</sup> 이온통로를 통한 전류와 막흥분성이 대조군에 비해 유의미하게 증가 하는 것을 관찰함. - CFC증후군 환자유래 iN cell들로부터 미니 흥분성 시냅스후 전류(mEPSC)를 측정하여, 시냅스전달에 있어 어떠한 변화가 있는지 조사 완료함. 결과적으로 mEPSC 빈도에는 차이가 없었으나 mEPSC 크기는 CFC증후군 iN cell에서 대조군에 비해 유의미하게 증가하는 것을 관찰함. : MEK 억제제에 의한 CFC증후군 환자유래 iN cell의 시냅스전달 특성 회복 연구 - CFC증후군 환자유래 iN cell들의 mEPSC 크기 변화가 MEK억제제(PD98059)를 처리하였을 때 회복되는지를 알아보기 위하여, 25 μM PD98059를 24시간 동안 처리하고 mEPSC를 측정 완료함. 결과적으로 CFC증후군 환자유래 iN cell들의 mEPSC 빈도는 대조군과 차이가 없었지만, 크기는 앞서 실험과 마찬가지로 대조군에 비해 유의미하게 증가하였고, MEK 억제제(PD98059) 처리에 의하여 mEPSC 크기 증가 변화가 대조군만큼은 아니지만 회복되는 경향성을 발견함. : BRaf 돌연변이 생쥐 제작 및 표현형 분석 - CaMKII 발현 신경세포 특이적인 조건발현을 위해 제작한 BRaf floxed 라인(BRaf(K499E))을 CaMKII-Cre(흥분성 신경세포에 Cre 재조합효소 발현)와 교배함. - CaMKII 발현 흥분성 신경세포 특이적으로 BRaf(K499E)를 발현시킨 돌연변이 생쥐에서 뇌신경발달에 어떠한 영향이 있는지 확인하고자 하였는데, 생후 3주일 된 생쥐와 성체 생쥐에서 모두 야생형(wild type)과 유사한 정상적인 뇌 구조를 보이는 것을 확인함. : BRaf 돌연변이 생쥐의 학습과 기억장애 분석 - 흥분성 신경세포에서의 BRaf(K499E) 발현이 생쥐의 기본적인 행동에 어떤 영향을 미치는지 알아본 결과 정상 수준의 locomotion, anxiety-like behavior를 보이는 것을 확인함. - CaMKII 발현 흥분성 신경세포 특이적으로 BRaf(K499E)를 발현시킨 경우 학습과 기억 장애가 나타나는지 확인한 결과, working memory에도 이상이 없었고 정상적인 hippocampus 의존적인 공간 기억을 형성함을 알 수 있었음. : 정량적 성과: SCI논문 6편(JCR 10%대 2편 포함) 게재, 특허 1건 출원 완료. □ 연구개발결과의 중요성 - ESC 유래 iN cell에서 CFC증후군 관련 BRaf 돌연변이 대체에 의한 Ras-MAPK 신호전달경로가 BRaf의 인산화효소 활성화 정도에 따라 활성화 또는 억제되는 것을 관찰함으로써 인간 신경세포에서도 Ras-BRaf-MAPK 신호전달경로가 동물모델에서와 동일하게 작동한다는 새로운 지식을 제공. - CFC증후군 환자 유래 신경세포들의 기본적인 전기적 특징들 중 Na<sup>+</sup> 이온통로를 통한 전류와 막 흥분성이 대조군에 비해 유의미하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 새로운 CFC증후군 병리기전으로 향후 질환 타겟 연구의 후보가 될 수 있을 것으로 사료됨. - CFC증후군 환자유래 iN cell들로부터 미니 흥분성 시냅스후 전류(mEPSC)를 측정하여 시냅스전달 특성을 확인한 결과, mEPSC 빈도에는 차이가 없었으나 mEPSC 크기는 CFC증후군 iN cell에서 대조군에 비해 유의미하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었음. - CFC증후군 환자유래 iN cell들의 mEPSC 크기 변화가 MEK억제제를 처리하였을 때 유의미하지는 않지만 회복되는 경향성을 보였는바, 인간에서도 동물모델에서와 마찬가지로 MEK억제제 계열의 치료제가 효과적으로 작용할 수 있을 것이며, 이는 향후 치료제 개발의 근거가 될 수 있을 것임. (출처 : 연구결과 요약문 2p) |
