| 초록 |
□ 연구개발 목표 및 내용 ￭ 최종 목표 2개의 핵을 가지고 있어 적합한 유전자 제거 방법이 없었던 람블편모충에 많은 진핵생물에 적용되고 있는 Cre/loxP와 CRISPR/Cas9 방법을 적용시켜 유전자 제거 기술을 구축하고자 하였음. 표적 단백질로 포낭형성에 중요한 전사단백질인 MYB2 단백질을 선정하고, 유전자 제거 기술을 이용한 myb2 유전자 제거 돌연변이 세포주를 구축하여 포낭형성 전사단백질인 MYB2 단백질의 기능을 심도있게 공부하고자 하였음. ￭ 전체 내용 람블편모충은 인체 소장에 기생하며 설사병을 일으키는 병원체임. 병원체라는 중요성 외에도 이 생물은 세포 구성 물질들을 살펴봤을 때, 진핵생물과 원핵생물의 특징을 모두 가지고 있다는 점에서 진화생물학적으로도 의미가 있는 생물임. 세포학적 측면에서도 2개의 핵을 가지는 생물로써 방향성(polarity)을 가지고 존재하는 8개의 편모, 중심체, 흡반이라는 특이적 구조을 세포분열 과정 동안 재배열하는 방식을 이해하는 모델 생물로써도 중요하다고 여겨짐. 하지만 아직까지 세포 구성 단백질의 기능 분석을 위해 유전자를 없애는 방법은 구축되어 있지 않고 있음. 따라서 본 연구에서는 람블편모충의 knockout 돌연변이 방법론을 확립하고자 하였음. □ 연구개발성과 CRISPR/Cas9 system과 Cre/loxP system을 람블편모충에 적용함. CRISPR/Cas9을 이용한 2단계의 homologous recombination 방법으로 람블편모충 myb2 유전자가 완전히 제거된 돌연변이 strain을 만들었음. 돌연변이 strain에 myb2 발현 construct를 넣어주어 complementation됨을 확인함. MYB2 항체를 이용한 chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq)을 이용하여 람블편모충 MYB2 단백질에 의해 조절받는 유전자들을 발굴함. ChIP-seq을 통해 발굴된 유전자들의 발현을 reporter system을 이용하여 야생형과 myb2가 제거된 돌연변이 람블편모충에서 발현차이를 관찰하고 MYB2 단백질에 의해 조절받는 유전자를 확인함. □ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과 본 연구진에 의해 확립된 CRISPR/Cas9 방법을 적용한 람블편모충의 유전자 제거 방법은 이 생물에서는 처음으로 정립한 방법으로 그동안 사용된 knockdown을 이용한 단백질의 일시적 발현저하를 유도하는 것이 아닌 유전자 제거(knockout)을 통해 람블편모충에서 특정 단백질의 기능 분석을 가능하게 함. 본 과제를 통해 정립한 방법으로 만들어진 myb2 유전자 제거 돌연변이 람블편모충을 이용해 람블편모충의 포낭유도과정에서 MYB2 단백질에의해 조절받는 새로운 단백질들을 발굴할 수 있게 되었음. 나아가 확립된 돌연변이 람블편모충을 이용하여 포낭유도 과정을 관장하는 단백질들의 그룹을 발견하는 기회가 마련되었고, 이를 통해 람블편모충에 대한 새로운 약제 target을 발굴할 수 있으리라 기대됨. (출처 : 요약문 2p) |
