| 저자(한글) |
LIU, Xue-jie,LIN, Wei-ran,TANG, Li-chun,SUN, Wei,WEI, Han-dong,JIANG, Ying |
| 초록 |
목적: RAB27A 유전자 만성바이러스(Lentivirus) 발현 벡터를 구축하고 RAB27A이 인간 HepG2 간암세포 증식 능력에 미치는 영향을 연구하는 것이다. 방법: pEGFP-C1-RAB27A 플라스미드를 템플릿으로 하고 PCR기법을 이용하여 녹색형광 단백을 융합할 수 있고 RAB27A 전체 길이를 가진 유전자를 증폭했다. 그리고 효소 절단 후 셔틀 벡터(shuttle vector) pENTR/U6에 삽입하고, Gateway 기술을 재활용하여 해당 유전자를 발현 벡터 pHAGEEF1α-puro-DEST위에 재조합시켜 재조합 만성바이러스 발현 벡터 pHAGE-GFP-RAB27A-puro를 구축하였다. 서열 측정을 통하여 서열의 정확성을 확인한 후, 해당 벡터와 패키징 플라스미드 psPAX2 및 세포막 플라스미드 pMD2.G를 HEK-293T 세포에 공동으로 형질전환시켜 만성바이러스를 포장하였다. 배양 상층액을 수집, 농축하여 얻은 만성바이러스 과립으로 HepG2 세포를 감염시켰다. 형광현미경으로 HEK-293T 세포와 만성바이러스가 HepG2 세포를 감염시키는 녹색 형광 강도를 관찰하였다; Western blot 기법으로 HepG2 세포주를 안정적으로 감염시켰을 때 RAB27A 단백질의 발현 수준을 검측하였다; CCK8과 페트리접시(Petri dish) 복제 형성 실험을 통하여 RAB27A를 안정적으로 과발현하는 HepG2 세포의 증식 활성 변화를 검측하였다; 유세포분석기술로 RAB27A를 안정적으로 과발현하는 HepG2 세포의 주기 분포 상황을 검측하였다. 결과: 이중효소 절단 및 서열 측정 결과를 통하여 재조합 만성 바이러스 발현 벡터 구축이 정확하다는 것을 증명하였다; 농축 후 바이러스 적정도가 높았다; 재조합 만성바이러스로 HepG2 세포를 감염시킨 후 세포 외인성 RAB27A의 단백질 발현 수준이 뚜렷하게 상향 조절되었고, HepG2 세포의 증식 활성과 클론체 형성 능력이 뚜렷한 억제를 받았으며(P 결론: RAB27A 유전자 재조합 만성바이러스 발현 벡터 구축에 성공했으며, 외인성 과발현 RAB27A 유전자가 HepG2 세포의 증식 능력을 뚜렷하게 억제할 수 있었다. RAB27A가 간세포암(Hepatocellular carcinoma) 발생 발전과 전이 과정에서 중요한 역할을 한다. |
