| 저자(한글) |
YU, Rong-jie,ZHONG, Jia-ping,CUI, Ze-kai,YANG, Yan-xu,ZHANG, Hua-hua |
| 초록 |
PAC1은 신경 펩타이드 뇌하수체 아데닐산고리화효소 활성화 폴리펩티드(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)의 특이적 수용체이다. B 계열 G-단백질 결합 수용체(G protein-coupled receptors)에 속하며 PACAP의 신경 전달 물질(Neurotransmitter), 신경 조절 물질(Neuromodulator), 신경 보호(neuroprotection), 신경 손상 저항(Anti nerve injury) 및 조절 신경 재생 등 기능을 유도하고 PAC1의 과발현은 신경 손상, 종양 등 생리적 및 병리학적 과정과 밀접한 연관이 있다. PAC1의 기능을 심층적으로 알아보기 위하여 PAC1의 발현을 제어할 수 있는 세포주를 구축하였으며 최적화한 테트라사이클린 발현 제어 시스템(Tetracycline expression system)을 통하여 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포 내에서 독시사이클린(doxycycline, Dox) 의존적 PAC1의 발현을 제어하였다. 먼저 이중 효소 절단을 통하여 PAC1과 강화형 노랑 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP)을 인코딩하는 융합 유전자 PAC1-EYFP를 pTRE-Tight 벡터에 복제하였으며 이를 통하여 재조합 벡터 pTRE-PAC1-EYFP를 얻었다. 다음으로 정확히 유전자 서열 측정 및 감정한 후 새로운 테트라사이클린 조절 요소 벡터 pTet-on advanced와 반응 요소 벡터 pTRE-PAC1-EYFP를 각각 CHO 세포에 형질주입하였으며 G418와 히그로마이신(Hygromycin) 2중 항체(Double antibody)로 양성 복제 PAC1-Tet-CHO를 선별하였다. 또한 경사도와 농도가 비슷한 테트라사이클린 유사물질의 독시사이클린 Dox로 PAC1-EYFP 발현을 유도하고 48시간 후 수용체의 발현 수준을 측정하며 MTT 방법으로 다양한 PAC1 발현 수준에서의 세포 증식 활성을 측정하였다. 형광 측정과 Western blotting 결과, 양호한 유도성이 있고 Dox 의존적 PAC1의 발현을 제어할 수 있는 세포주를 성공적으로 얻었으며 해당 세포주는 10세대에 걸쳐 배양한 후에도 여전히 PAC1의 발현을 제어할 수 있다. MTT 결과, PAC1 발현 수준이 높을수록 세포 증식 활성이 더욱 강해진다. Dox 의존적 PAC1 발현 제어 세포주의 성공적인 구축은 PAC1의 생물학적 기능을 심층적으로 연구하는데 기반을 마련하였다. |
