| 저자(한글) |
HE, Tie-fan,XU, Sha,ZHANG, Ge-yuan,NAKANISHI, Hideki,GAO, Xiao-dong |
| 초록 |
[목적] 맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 인간화 당단백(human glycoproteins)을 생산하기 위하여 반드시 N-글리코실화(N-glycosylation) 경로에 대한 유전자 공학 개조를 진행해야 한다. 연구진은 효모의 N-글리코실화 경로 중의 일부 특이성 글리코실 전이효소(glycosyltransferase)를 녹아웃(knock out)하여 인간 클리코실 전이효소를 지속 발현하는데 사용할 수 있는 하나의 재조합균을 획득하였다. 또한, 성장 적응성 진화 기술을 이용하여 상기 재조합균의 세포 성장 능력을 회복하였다. [방법] 먼저, 효모 유전학과 분자생물학 기술을 이용하여 맥주 효모의 α-1, 3-만노실 전이효소(Mannosyl transferase) 유전자(ALG3), α-1, 6-만노실 전이효소 유전자(OCH1) 및 α-1, 3-만노실 전이효소 유전자(MNN1)를 녹아웃하였다. 자당효소(invertase) 활성 염색 실험을 이용하여, N-연결 올리고당(N-linked oligosaccharides)의 변화를 초보적으로 측정하고, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)와 만노시다아제(mannosidase) 처리를 통하여 올리고당 연결 구조를 감정하였다. 고온 조건에서 재조합균에 대한 성장 적응성 진화를 진행하여 성장 능력 돌연변이 균주를 선별하였다. [결과와 결론] △alg3△och1△mnn1 균주를 구축하여 인간 N-글리코실화 중간체 Man 5 GlcNAc 2 를 획득하였고, 상술한 3개의 결실형 균주에 대한 적응성 진화를 진행하여 세포의 성장 능력과 환경 적응 능력을 향상하였다. 또한, 상기 재조합균에서 소량의 Man 6 GlcNAc 2 구조의 중간체(intermediate)를 발견하였다. 체외 α-1, 2-만노시다아제(mannosidase) 처리 후, Man 5 GlcNAc 2 와 Man 6 GlcNAc 2 는 모두 Man 3 GlcNAc 2 로 전환하였다. 이는 Man 3 GlcNAc 2 를 형성한 후의 만노스(seminose) 사이는 모두 α-1, 2-glucosidic bond로 연결되었다는 것을 설명한다. △alg3△och1△mnn1 균주의 구축을 통하여 인간화 당단백의 맥주 효모 발현 시스템을 획득하였고, 글리코실화 개조와 공업 응용을 위한 양호한 기반을 마련하였다. |
