| 저자(한글) |
HUANG, Hui,HU, Guang-dong,KANG, Jian,QING, Su-zhu,ZHANG, Yong |
| 초록 |
고효율적이고 일반적인 세포 불멸화(Cell immortalization) 벡터 pTP-hTERT를 구축하기 위하여 인공 합성, PCR, 효소 절단 연결 등 방법을 통하여 기존의 piggyBac(PB) 전이인자(transposon) 시스템을 개조하였다. 개조 후의 벡터에는 전이인자 필수 소자, PB 전이 효소(PBase) 발현 틀, 공동 발현 선별 소자와 인공 말단 입자 역전사효소(hTERT) 유전자 발현틀이 포함된다. 선별 소자에서 녹색형광단백질(EGFP) 유전자와 퓨로마이신(Puromycin) 항성(Puro r ) 유전자는 돼지엔테로바이러스(porcine enterovirus) 2A의 자아 절단 펩티드를 통하여 연결되고 공동 발현된다. 벡터 소자의 기능을 검증하기 위하여, 해당 벡터를 사용하여 HEK 293 세포를 형질전환시켰으며 선별한 양성 세포에 대하여 RT-PCR, Western blotting(WB), Tail-PCR과 세포 복제 메틸렌블루 염색 및 통계 분석을 수행하였다. 벡터 서열에 대한 측정과 감정 및 세포에 대한 배양 결과, 일반형 불멸화 벡터 pTP-hTERT를 성공적으로 구축하였고 HEK293 세포를 형질전환 시킨 후, 퓨로마이신 세포의 단일 복제를 선별할 수 있다; WB 결과, P2A는 EGFP와 Puror 융합 단백질을 고효율적으로 절단할 수 있다. 이는 선별 표기 유전자의 기능이 정상이라는 것을 증명한다; Tail-PCR 결과, 해당 벡터는 전이인자의 통합 삽입 방식을 통하여 숙주 유전체에 삽입된다; 메틸렌블루 염색 및 통계 결과, pTP-hTERT로 인한 세포 양성 복제수가 대조그룹의 양성 복제수보다 선명하게 향상되었다.(P PB 전이인자 불멸화 벡터 pTP-hTERT의 구축은 불멸화 세포계의 구축에 도구를 제공하였을 뿐만 아니라, 기타 진핵 벡터의 구축과 개조에도 참고를 제공하였다. |
