| 저자(한글) |
LI, Hui-ying,ZHU, Yun-ming,MIN, Wei-hong,ZHAN, Dong-ling,REN, Jun |
| 초록 |
[목적] Corynebacterium pekinense 중의 아스파르트산 키나아제(aspartokinase, AK) 활성을 높이고자 한다. [방법] 정점 돌연변이 기술을 이용하여 AK 유전자에 대한 돌연변이를 진행하고, 그 돌연변이체를 대장균(Escherichia coli) BL21에 이전하여 이종발현하였다. 재조합균에 대한 초음파처리(ultrasonicating) 후, 니켈 컬럼(nickel column)을 이용하여 정제하고, SDS-PAGE와 Western blot로 검증하였다. 효소 활성 검측을 통하여 돌연변이체와 야생형의 동력학적 변화를 비교하고, 돌연변이체와 야생형의 일부 효소 특성을 연구하였다. [결과] 성공적으로 돌연변이체 R169H를 구축하였다. 검증 결과, AK 분자량은 48kDa였다. 돌연변이체 R169H의 V max 는 226.3U/mg·s -1 이며, 이는 야생형의 2.3배이었다. 최적 반응 온도는 26℃이며, 이는 야생형의 경험식에서 얻어진 값과 일치했다. 최적 반응 pH는 9.0이며, 이는 야생형의 경험식값 8.0보다 다소 높았다. 최적 온도와 최적 pH 조건에서 반감기(half-life)는 5.5시간이며, 이는 야생형의 4시간보다 안정성이 좋았다. 대사산물 라이신(lysine), 트레오닌(threonine) 및 메티오닌(methionine)은 저농도일 때, 모두 AK에 대해 활성화 작용을 한다. [결론] 돌연변이체 중의 R169와 E92 사이에는 수소 결합(hydrogen bond)이 소실되었다. 이는 소단위(subunit) 사이의 중합도에 영향을 미치고, 기질에 대한 효소의 친화성을 낮추며, 대사산물의 AK에 대한 피드백 억제 작용을 약화시킬 수 있다. 따라서, R169H 중의 AK의 V max 는 2.3배 제고되었다. |
