| 저자(한글) |
ZHANG, Cheng-lin,LIU, Yuan,XUE, Ning,WANG, Xin-xin,XIE, Xi-xian,XU, Qing-yang,CHEN, Ning |
| 초록 |
【목적】Bacillus thuringiensis TCCC 11826로부터 얻은 L-아이소루신-4-히드록실라아제(L-isoleucine-4-hydroxylase, IDO)를 클로닝하고 발현하며, 재조합 IDO의 효소학적 성질을 측정하고 4-하이드록시이소류신(4-Hydroxyisoleucine, 4-HIL)의 미생물 형질전환에 이용할 수 있는 재조합 균주를 구축하여, 4-HIL 합성에서의 해당 효소의 잠재적 응용 가치를 고찰한다. 【방법】B. thuringiensis TCCC 11826 유전체를 템플릿으로 하고, PCR을 이용하여 ido 유전자를 증폭하였으며, 해당 유전자의 과발현 균주 BL-IDO를 구축하였다. Ni-NTA 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 재조합 IDO를 분리하고 정화한 후, 효소학적 특성을 측정하였다. 재조합 균주 W3110-IDO를 구축하여 4-HIL의 미생물 형질전환을 진행하였다. 【결과】B. thuringiensis TCCC 11826의 ido 유전자를 클로닝하였다. 서열 측정 결과에 따르면 해당 유전자는 723개의 뉴클레오티드(nucleotide)를 갖고 있으며, 240개의 아미노산을 코딩할 수 있다. 이미 보도된 B. thuringiensis 2-e-2의 ido 유전자와의 유사도는 각각 97.47%과 97.91%였다. 해당 IDO은 His 1 -X-Asp/Glu-Xn-His 2 모티프(motif)를 갖고 있었으며, Fe 2+ 과 α-케토글루타르산(α-ketoglutarate) 의존형 히드록실라아제 패밀리에 속하였다. 효소학 실험 결과, 해당 효소는 L-아이소루신이 (2S,3R,4S)-4-HIL을 생성하는 데 특이성 촉매작용을 하였으며, K m 과 V max 는 각각 0.18 mmol/L과 2.10 μmol/min/mg, 최적의 반응 온도와 pH는 각각 35℃와 7.0이었다. 35℃ 조건에서 5시간 방치된 후, 해당 효소는 여전히 85.1%의 활성을 나타냈다. 최적화 조건을 거치지 않을 때, Escherichia coli W3110 내 과발현 재조합 IDO의 4-HIL로의 최대 형질전환율은 89.28%에 달하였다. 【결론】IDO 코딩 유전자의 서열( Accession No. KC884243 )을 얻었으며, 최초로 효소학적 특성을 체계적으로 연구하였다. 따뜻하고, 활성이 높으며, 안정성이 높은 등 반응 조건은 해당 효소법 혹은 미생물 형질전환법으로 4-HIL을 합성하는 데 비교적 광범위한 응용 가치를 갖고 있었다. 본 연구는 4-HIL 및 기타 아미노산 유도체의 바이오 제조 기술을 위하여 이론적 기반을 마련하였다. |
