| 저자(한글) |
ZHAO, Tong-wei,ZHANG, Bing,LV, Wen-jing,DI, Hui-feng,WU, Tao-yan,ZHANG, Shi-yang,TANG, Xiao-wei,FENG, Cong-jing |
| 초록 |
【목적】곤충 체내 프로페놀옥시다아제(prophenoloxidase, PPO)는 중요한 천연적 면역 단백질로서 곤충의 체액 면역 및 세포 면역 과정에 참여한다. 본 연구는 원핵발현 시스템(prokaryotic expression system)을 이용하여 용해 가능하고 활성이 있는 재조합 PPO 단백질을 대량 발현시킨 다음, 각 종 페놀산화효소(phenoloxidase, PO) 억제제로 이용되는 재조합 PPO를 선별한다. 이로써 곤충 면역 시스템 억제를 위한 새로운 살충제 제조에 조건을 마련한다. 【기법】생후 5일인 아시아 조명나방(Ostrinia furnacalis) 유충 체내에서 PPO 유전자를 복제하였고 pET-28b-PPO 원핵발현 벡터를 구축하였으며 대장균에서 아시아 조명나방 PPO 단백질을 재조합 발현시켰다. Ni-NAT 친화성 크로마토그래피 칼럼(affinity chromatography column)을 사용하여 목표 단백질을 빠르게 정제하였고 웨스턴 블로팅(western blotting) 방법으로 단백질을 검정하였다. 재조합 PPO 단백질로 활성화시킨 PO의 효소학 성질 및 각 금속 이온(Mg 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ )이 PPO 2차 구조에 미치는 영향을 측정 및 분석하였다. 【결과】융합 단백질 PPO를 발현 및 정제하였다. 재조합 PPO 단백질로 PO를 활성화시킨 후 최적 반응 온도 30℃, 최적 pH 7.2, L-DOPA를 기질로 하였을 때 PO 촉매반응의 V max 는 140.8U/mg·min, Km은 2.96mmol/L였다. Fe 2+ 존재시 재조합 PPO 단백질의 β-병풍구조(β-sheet) 성분은 53.7%±4.6%로 뚜렷하게 증가하였고 α-나선구조(α-helix) 성분은 2.6%±1.2%로 뚜렷이 감소하였다(P 2+ 존재시 재조합 PPO 단백질의 β-병풍구조 성분은 뚜렷이 감소하였고 α-나선구조 성분은 조금 증가하였다. Cu 2+ 존재시 재조합 PPO 단백질의 β-병풍구조 성분은 10.0%±1.6%로 뚜렷이 감소하였고 α-나선구조 성분은 35.3%±6.9%로 증가하였다. 【결론】연구 결과 각 금속 이온은 재조합 PPO 단백질의 2차 구조에 뚜렷한 영향을 미쳤다. |
