| 저자(한글) |
SHI, Zhen-hua,MENG, Chuang,XU, Zheng-zhong,WAN, Ting,SHAN, Fa,CHEN, Xiang,JIAO, Xin-an |
| 초록 |
피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 시스템의 융합 단백질을 이용하여 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)의 배양 여과액 단백질 10(culture filter protein 10, CFP10)과 초기 분비 항원 표적 6 단백질(earlier secreted antigen target 6, ESAT6)을 발현하고, 소 결핵병(Bovine tuberculosis) 말초혈 인터페론γ(interferon gamma, IFN-γ)의 체외 방출 실험을 위한 특이성 자극제로 이용되어 소 결핵병을 진단할 수 있는 잠재력을 평가하였다. PCR을 통하여 cfp10-esat6 융합 유전자를 증폭시키고, pPICZαA-(cfp10-esat6) 재조합 플라스미드를 구축한 후, 전기 충격을 이용하여 피치아 파스토리스에 형질주입하고, 최종 농도가 1.0%인 메탄올을 첨가하여 3일 동안 유도하였다. 다음, 배양 상청액을 수집하여 SDS-PAGE 분석을 진행하고, 니켈이온 금속 킬레이트화 친화성 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 표적 단백질을 정제하였으며, Western blot을 이용하여 재조합 단백질의 면역 반응성을 분석하였다. 정제한 융합 단백질 CFP10-ESAT6를 자극제로 하여, 소 결핵병 말초혈 IFN-γ의 체외 방출 실험에 사용하였으며, 해당 단백질의 소 결핵병 진단가치를 평가하였다. 연구 결과, 표적 단백질(33 kD)를 분비, 발현시키는 데 성공하였는데, 해당 융합 단백질은 항 CFP10, ESAT6, 히스티딘(histidine) 태그와 c-Myc 등 4가지 단일클론 항체와 모두 특이성 반응을 일으켰으며, 비교적 양호한 면역 반응성을 갖고 있었다. 165부 젖소 말초혈 샘플의 IFN-γ을 검출한 결과, CFP10-ESAT6 융합 단백질과 투베르클린 정제 단백질 유도체(purified protein derivative, PPD)는 자극제로 이용될 수 있었으며, 양자의 양성 일치율은 82.3%, 음성 일치율은 78.8%였다. 본 연구는 효모 발현 시스템을 이용하여 CFP10-ESAT6 융합 단백질을 성공적으로 발현시켰으며, 생물학적 활성을 향상시켰다. 소 결핵병 말초혈 IFN-γ의 체외 방출 실험에서 후보 자극제로 이용될 수 있었으며, 혼합 감염으로 인한 PPD 누락 검출 문제를 극복함으로써, 검출 민감성과 특이성을 한층 더 향상시켰다. |
