| 저자(한글) |
DIAO, Yan-jun,LIU, Jia-yun,MA, Yue-yun,SU, Ming-quan,HAO, Xiao-ke |
| 초록 |
목적 : 3TAT-DRBD 재조합 벡터를 구축하고, 융합단백질(fusion protein)을 발현 및 정제하였다. 그리고 3TAT-DRBD 재조합 벡터가 siRNA와의 결합활성과 막투과 기능(membrane-penetrating function)을 검사하였다. 방법 : 유전자 합성기술을 이용하여 표적 유전자 3TAT-DRBD를 얻은 후 원핵발현벡터(prokaryotic expression vector) pET-44b에 클론하였다. 그리고 IPTG로 융합단백질의 발현을 유도하고, 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼(Ni-NTA)으로 융합단백질을 정제하였으며, 트롬빈(thrombin)으로 단백질 태그(protein tags)를 제거하고, 웨스턴 블로팅법(western blotting)으로 감정하였다. 겔전기영동 실험(electrophoretic mobility shift assays, EMSA)으로 DRBD과 siRNA의 결합기능을 입증하고, 또한 공초점 주사레이저현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)으로 전사활성인자(transcriptional activator of transcription, TAT)의 막투과 기능을 관찰하였다. 결과 : 제한효소절단(restriction enzyme digestion)과 유전자 서열측정 결과, 재조합 플라스미드 pET-44b-3TAT-DRBD는 성공적으로 구축된 것으로 나타났다. IPTG로 유도 후 3TAT-DRBD 융합단백질(Nus태그와 S태그 포함)은 대장균에서 고효율 발현(efficiently expressed)되었고, 가용성 단백질은 균체 총단백질의 약 80%를 차지하였다. 그리고 융합단백질 태그를 성공적으로 제거하였으며, 또한 태그가 없는 융합단백질을 정제한 후 웨스턴 블로팅법으로 pET-44b-3TAT-DRBD의 상대분자량을 측정한 결과 약 17000인 것으로 나타났으며, 겔전기영동 실험으로 융합단백질 3TAT-DRBD가 표적 생존(surviving) 유전자의 siRNA(survivin-siRNA)와 효과적으로 결합될 수 있다는 것을 입증하였으며, 공초점 주사레이저현미경으로 관찰한 결과, TAT의 유도로 survivin-siRNA가 세포막을 투과하여 전립선암(prostate cancer) PC3세포에 진입하는 효율이 뚜렷하게 증가된 것으로 나타났다 결론 : siRNA와 결합활성이 있고, 또한 막투과 기능이 있는 3TAT-DRBD 융?단백질을 발현 및 정제하였다. 이는 3TAT-DRBD의 기능에 대한 심층적 연구 및 임상응용에 기초를 마련하였다. |
