| 저자(한글) |
CHEN, Xin-yu,PANG, De-jian,OU, Xiao-li,JIANG, Yong,MEI, Zhu-zhong |
| 초록 |
[목적] 유도 가능한 CRISPRi 시스템을 구축하여 표적 유전자의 발현을 특이하게 억제한다. [방법] PCR 기술을 이용하여 인체 ZNF10 유전자의 KRAB 도메인 코딩 서열을 각각 dCas9 단백질 코딩 유전자의 5'단(KRAB-dCas9)과 3'단(dCas9-KRAB)에 복제하였다. 루시페라아제 보고유전자(luciferase reporter gene) 개시코돈(initiation codon) 부근 서열을 표적으로 하는 4가지 gRNA 발현 벡터를 설계하고 구축하였으며, 그 발현은 TetO 조절 요소를 함유한 H1 프로모터에 의해 조절되었다. dCas9 단백질과 gRNA 공발현이 공동 형질전환한 루시페라아제 보고유전자 발현 수준에 미치는 영향을 분석하였다. 이에 기반하여 인체 KLHL21 유전자 전사 초기 사이트 부근 영역을 표적으로 하는 3가지 gRNA 발현 벡터를 설계 및 구축하였고, 이것과 KRAB-dCas9 융합 발현 벡터를 각각 HEK293T 세포에 공동 형질전환시켰으며, 24시간 후 세포를 수집하여 형광 실시간 정량 PCR과 western blotting으로 KLHL21 유전자 발현 수준의 변화를 분석하였다. [결과] CRISPRi 시스템은 HEK293T 세포 중 루시페라아제 보고유전자와 내인성 KLHL21 유전자의 발현을 효과적으로 억제하였다. 공발현한 TetR 억제 단백질은 루시페라아제 보고유전자 발현에 대한 CRISPRi 억제 작용을 차단할 수 있으며, 세포 배양기에 1 μg/ml 염산 테트라사이클린(tetracycline)을 첨가하여 이러한 억제 작용을 해제할 수 있다. [결론] 유도 가능한 CRISPRi 시스템을 성공적으로 구축하였으며, 진핵 세포 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있었다. |
