| 초록 |
목적: 독소 원성 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) K99 핌브리아 fan 오페론(K99 fimbriae fan operon) 구조 유전자를 체외 클로닝하고 발현시키며 핌브리아 재조합과 연관되는 바이오학 활성을 검출하는 것이다. 기법: 돼지에서 분리 및 발현된 K99 핌브리아 ETEC C833907주에서 샘플을 채취하여 성공적으로 5.7kb되는 K99 핌브리아 fan 오페론을 PCR 증폭하였다. 다음 fan 오페론을 발현 벡터 pBR322에 클론한 후 양성 플래스미스 재조합 균주를 선별해낸다. 그리고 서술한 재조합 플래스미스 DNA를 비핌브리아(non-fimbriae) 대장균 SE5000주로 변환시키는 동시에 빈 벡터 pBR322 플래스미스를 SE5000로 변환시켜 음성 대조 균주를 구축하였다. 결과: 해당 재조합 균주는 쥐 항(mouse anti) K99 핌브리아 단일 클론 항체(monoclonal antibody)와 신생 돼지 상피세포 분자와 뚜렷한 응집반응을 일으켰다. 전자현미경(electromicroscope)으로 관찰한 결과 해당 재조합 균주 표면에는 다량의 K99 핌브리아가 발현되었으며 발현된 핌브리아를 열제거법(Heat extraction method)으로 추출해낸 후, SDS-PAGE 전기 영동과 Kaumas blue 염색을 거쳐 분자량이 18.5kDa되는 단백질 밴드를 얻었다. 핌브리아를 순화하여 마우스를 면역한 후 고역가의 쥐 항 혈청을 제조하였으며 이는 C83907, C83914, C83260 야생주와 강렬한 응집반응을 일으키지만, 기타 ETEC와는 반응하지 않는다. 유리판 응집 실험과 Westernblot 결과에 따르면, 체외 발현된 K99 핌브리아는 야생 K99 핌브라아와 같은 항원성을 가졌다. 발현된 K99 핌브리아를 재조합 균에 HeLa 세포 체외 부착 억제실험을 진행한 결과, 재조합 균과 야생균주는 모두 비교적 강한 부착성을 가지고 있지만 재조합 핌브리아로 제조한 쥐항 혈청은 위에서 서술한 재조합 균과 세포계와 결합을 효과적으로 억제한다는 것을 설명한다. 토의: 본 연구는 K99 핌브리아 바이오학 연구를 위해 양호한 테스트 플랫폼을 구축하였다. |
