| 저자(한글) |
GUAN, Qi-wang,MA, Jiang-feng,HE, Ai-yong,JIANG, Min,GONG, Chang-bin |
| 초록 |
본 논문은 아시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis)의 니트릴라아제(nitrilase) 유전자를 함유한 클론 플라스미드를 템플릿(template)으로 하고, PCR 증폭으로 길이가 1,080 bp인 니트릴라아제 유전자 단편을 획득하였다. 그리고 발현 플라스미드 pET-28-a를 이용하여 발현 벡터를 구축하였고, 재조합 플라스미드 pET-Nit를 획득하였다. 발현된 유전자에 대하여 서열 측정 및 비교를 진행한 결과, 해당 유전자는 유전자은행(GenBank)에서 보고한 유전자 서열과 유사성이 99%였으며, 해독틀(reading frame)에 2 bp인 돌연변이가 발생하였지만 대응되는 아미노산의 돌연변이가 유발되지 않았다. 그러므로 효소의 발현 및 특성에 영향을 미치지 않았다. 재조합 플라스미드를 발현 숙주인 Escherichia coli Rosetta(DE3)의 수용성 세포(competent cell)에 전환한 후 유도제 IPTG로 균주를 유도 발현하여 획득한 균액에 대하여 SDS-PAGE 분석을 진행한 결과, 표적 단백질의 분자량이 41.28 kD였고 예측 결과와 일치하였다. 효소 활성을 분석한 결과, 상청액의 비활성(specific activity)이 3 U/mg이었다. 유도 온도, IPTG 농도, 유도 시간 등 일련의 유도 조건을 한층 더 최적화하였다. 최적화 조건에서 배양 체적(culture volume)을 확대하여 배양한 결과, 비활성이 15 U/mg에 도달하였고, 활성이 약 5배 증가하였다. |
