| 저자(한글) |
ZHOU, Yan-yan,LIU, Xin-li,CHEN, Jing,HU, Hong-yu,HOU, Yun-hua |
| 초록 |
【목적】Pichia pastoris에서 검정곰팡이(Aspergillus niger) h408의 feruloyl esterase A 유전자(AnfaeA)를 고효율로 발현시키고, 재조합 효소의 특성을 묘사한다. 【방법】OE-PCR(overlap extension PCR)를 이용하여 검정곰팡이 h408의 feruloyl esterase A 유전자를 증폭하였다. AnfaeA 유전자와 Pichia pastoris 발현 벡터 pPIC9K을 연결시켜 재조합 플라스미드 pPIC9K-Anfae를 성공적으로 구축하였으며, 선형화를 통하여 P. pastoris GS115에 대한 전기충격 형질전환(electrotransformation)을 진행하였다. 투명서클(transparent circle) 기법으로 높은 활성을 갖춘 형질전환체를 선별한 후, 발현을 유도하였다. 자외선 흡수법을 이용하여 온도 및 pH가 재조합 feruloyl esterase의 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 【결과】A. niger h408로부터 feruloyl esterase A의 cDNA 유전자(GenBank: KF911349)를 성공적으로 클로닝하였으며, P. pastoris GS115에서 해당 유전자의 고효율 발현을 실현하였다. 해당 유전자의 길이는 783bp, 1개 개방형 해독틀(Open Reading Frame, ORF)을 갖고 있었으며, 260개 아미노산을 코딩할 수 있었다. Blast 분석을 통하여 해당 유전자와 GenBank의 검정곰팡이 feruloyl esterase 서열의 상동성이 99%라는 것을 알 수 있었다. 번역한 아미노산 서열은 리파아제(lipase)의 전형적인 활성 뚜껑(active lid)과 촉매 3량체(catalytic triad) 구조를 갖고 있었다. 형질전환 평판에서 얻은 번호가 pPIC9K-Anfae5인 형질전환체의 feruloyl esterase 활성이 가장 높았으며, 효소의 활성이 24.72 U/mL, 비활성(specific activity)이 40.84 U/mg, 검정곰팡이 원시 균주(22.1 mU/mL)보다 약 1,100배 향상되었다. 재조합 feruloyl esterase의 최적 pH는 5.0였으며, pH 4.0-9.0일 때 안정성이 비교적 양호하였다. 최적의 반응 온도는 50℃였으며, 40-60℃일 때 비교적 안정적이었다. 【결론】Pichia pastoris 내 feruloyl esterase의 고효율 분비 발현은 사료산업과 제지산업에서의 산업화 응용을 위하여 기반을 제공하였으며, 또한 향후 효소학 특성의 정향 진화(orthogenesis)를 개선하는 데 실험 기초를 마련하였다. |
