| 저자(한글) |
HUANG, Qing,ZHANG, Yi-quan,HU, Xiao-xu,WANG, Li,YANG, Rui-fu,ZHONG, Qing-ping,ZHOU, Dong-sheng,LI, Xiao-min |
| 초록 |
[목적] 표현형과 분자 생화학적 실험 연구를 종합하여 AphA 단백질의 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 생물막 형성에 대한 조절 메커니즘을 연구하였다. [방법] 균락 형태(Colony morphology)와 크리스털 바이올렛 염색(crystal violet staining) 실험을 통하여 aphA 돌연변이 균주(△aphA)와 야생 균주(WT)의 표현형 차이를 비교하였다. 또한, HPLC-MS/MS 방법을 이용하여 △aphA와 WT 중의 c-di-GM 분자 함량을 각각 측정하였다. △aphA와 WT의 총 RNA를 추출하고, 실시간 정량 RT-PCR 방법을 이용하여 AphA의 scrABC와 scrG에 대한 조절 관계를 연구하였다. scrABC와 scrG의 상류 프로모터 구간을 복제한 LacZ 재조합 플라스미드(plasmid)를 각각 구축하고, 상기 재조합 플라스미드를 △aphA와 WT에 삽입하였다. 두 균주의 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성의 차이를 비교하여 AphA의 scrABC와 scrG에 대한 조절 관계를 심층 연구하였다. scrABC와 scrG의 전체 프로모터 구간의 DNA 서열을 PCR 증폭하고, His-AphA 단백질을 정제하였으며, 전기영동 이동성 이동 분석 실험(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 통하여 AphA의 표적 유전자 프로모터 구간에 대한 직접적인 상호작용 여부를 검증하였다. [결과] 표현형 분석 결과, AphA는 c-di-GMP의 합성과 생물막 형성을 촉진할 수 있었다. 실시간 정량 RT-PCR과 LacZ 결과, AphA는 scrABC와 scrG의 전사 발현을 억제할 수 있었다. EMSA 결과, AphA는 scrABC와 scrG의 프로모터 구간의 DNA에 결합하지 못하였다. [결론] AphA가 scrABC와 scrG의 발현을 간접 억제하는 것은 AphA가 장염비브리오 c-di-GMP의 합성과 생물막 형성을 촉진하는 메커니즘 중의 하나이다. |
