| 저자(한글) |
ZHOU, Zuo-qiong,PENG, Xi-yang,XIAO, Li-na,LI, You-feng,PENG, Hao,WU, Xiu-shan,FAN, Xiong-wei,LI, Yong-qing |
| 초록 |
목적: 실험용 작은 쥐의 Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein10) 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 구축하는데 있다. 방법: 실험용 작은 쥐의 Lrrc10 특이성 프라이엄을 설계하고 실험용 작은 쥐의 cDNA를 견본(template)으로 하며, PCR 방법을 사용하여 mLrrc10의 코딩 영역을 증폭시켰다. 그리고 HA 라벨 단백질과 SalΙ 효소 절단 위치를 도입하였다. 해당 조각에 대하여 겔 전기영동 정제 후 pMD-18T 벡터를 삽입하였다. 서열 측정 후, SalΙ와 Hind III 효소 절단을 사용하여 표적 조각을 pAd-track-cmv 셔틀 벡터(Shuttle vector)에 서브클로닝(Subcloning)시켰다. PmeΙ 선형화 후, 100 ng의 전환 세균 BJ5183을 사용하여 세균 내에서 상동 재조합시켜 pAd-Lrrc10 플라스미드를 얻었다. pAd-Lrrc10은 PacⅠ 선형화 후 LipofectamineTM 2000으로 293A 세포를 형질전환 시키고, 포장을 통하여 Lrrc10 유전자를 함유한 바이러스 재조합 체(recombinant)를 얻었다. 해당 바이러스 재조합체를 293A 세포에서 증폭시킨 후 반복적인 동결융해(freeze-thaw cycle) 과정을 통하여 적정 농도가 비교적 높은 Lrrc10을 함유한 바이러스 액체를 얻었다. 수집한 바이러스 액체로 심근세포를 감염시키고 녹색 형광법으로 GFP를 관찰하였으며 면역 블로팅 방법으로 Lrrc10-HA 단백질의 발현을 검측하였다. 결과: 바이러스 액체로 1차 심근세포를 감염시켜서 24시간 지난 후 형광 현미경으로 감염된 세포가 발광하는 녹색 형광을 관찰할 수 있었다. 그리고 심근세포의 총 단백질을 추출하고 Western방법으로 Lrrc10-HA 융합 단백질의 발현을 검측할 수 있었다. 결론: 실험용 작은 쥐의 Lrrc10 아데노바이러스 벡터를 성공적으로 구축하였을 뿐만 아니라, Lrrc10-HA을 코딩하는 표적 조각을 심근세포에 도입하여 발현시킬 수 있다. |
