| 초록 |
목적 : 표적 표피생장인자 수용체(epithelial growth factor receptor, EGFR) 잠재항원 결정기(cryptic epitope) (287-302)의 면역독소(immunotoxin)를 제조한 후 그 생물학적 기능을 검정하는 것이다. 방법 : 유전자 공학 방법으로 EGFR(287-302)의 806 단사슬 항체 (806 single-chain antibody fragment, 806scFv) 유전자를 유연 펩티드(flexible peptide)와 녹농균 외독소 A Pseudomonas exotoxin A, PEA)의 절단 형태(truncated form) PE38KDEL와 결합시켜 원핵발현 벡터(pET-22b-806scFv-PE38KDEL)를 구축하고 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켰으며, 정제하여 면역독소 융합 단백질 806scFv-PE38KDEL을 얻었다. 그리고 ELISA법과 유세포분석법(flow cytometry)으로 806scFv-PE38KDEL과 EGFR의 결합활성을 검사하고, 간접멱역형광법(indirect immunoflouresence)으로 재조합 면역독소의 내재화 작용(internalization)을 검사하였으며, CCK-8법으로 806scFv-PE38KDEL가 인간 뇌신경교종세포(human glioma cell) U87MG와 U87MG-EGFRvⅢ, 표피 암세포A431 (epidermis tumor cell A431), 유선암세포 MDA-MB-468(breast cancer cell MDA-MB-468), 설암세포CAL-27(tongue cancer CAL-27 cell)에 대한 세포독성을 검사하였다. 결과 : 재조합 면역독소 806scFv-PE38KDEL를 성공적으로 구축하였고, 또한 발현단백질 806scFv-PE38KDEL을 유도하여 봉입체(inclusion body) 형식으로 존재하게 하였는데 정제 후 순도가 95%이상에 달하였다. 그리고 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅(Western blotting)법으로 검정한 결과 표적 단백질이 합성된 것으로 나타났다. 806scFv-PE38KDEL는 EGFRvⅢ의 세포외에서 단백질과 결합될 수 있고, 또한 EGFRvⅢ를 외인성 발현(exogenous expression) 하는 종양세포 및 EGFR를 고발현하는 종양세포와 결합되지만, EGFR를 저수준 발현(low level expression)하는 종양세포와 결합되지 않는다. 806scFv는 재조합 면역독소의 내재화 작용을 유도하였다. 806scFv-PE38KDEL는 표적 세포에 대하여 뚜렷한 살상작용이 있고, 또한 EGFRvⅢ가 과발현되는 U87MG-EGFRvⅢ 세포에 대한 IC 50 값은 (5.85±0.03)ng/ml이고, EGFR가 고발현되는 MDA-MB-468, A431, CAL-27에 대한 IC 50 값은 각각 (162.80±0.06), (75.72±0.04), (123.70±0.03)ng/ml인 것으로 나타났다. PBS 대조그룹에 비하여 면역독소 806scFv-PE38KDEL의 농도가 1 mu;g/ml일 때 806scFv-PE38KDEL가 U87MG-EGFRvⅢ, MDA-MB-468, A431와 CAL-27 세포의 증식에 대한 억제율은 뚜렷하게 높지만[(98.67±0.07)% vs (2.45±2.85)%, (86.26±1.01)% vs (0.48±1.76)%, (96.72±0.16)% vs (1.33±1.31)%, (96.29±0.30)% vs (2.00±0.60)%, P lt;0.01], U87MG세포의 증식에는 억제작용이 없었다[(3.59±2.09)%vs(0.19±0.95), P gt;0.05]. 결론 : 본 연구에서 제조한 표적 EGFR(287-302) 항원결정기의 재조합면역독소 806scFv-PE38KDEL는 특이적으로 EGFRvⅢ 혹은 EGFR이 고발현되는 종양세포와 결합되어 살상작용을 한다. |
