| 저자(한글) |
WANG, Lu,LIU, Gui-ming,ZHANG, Ying-zi,WANG, Yu,DING, Jiu-yuan,WENG, Wei-qi |
| 초록 |
【목적】대사공학을 통하여, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) W50-EAB의 자일로오스(xylose) 대사 관련 율속 표적을 수정하고 랄스토니아 유트로파 W50-EAB의 D-자일로오스 이용 효율을 더 한층 향상하여 셀룰로오스 가수분해액을 효과적으로 이용할 수 있는 균주를 얻는데 기반을 마련하고자 한다. 【방법】PCR 기술을 이용하여 랄스토니아 유트로파의 트랜스케톨라제(transketolase) 유전자 tktA, cbbT2과 트랜스알돌라아제(transaldolase) 유전자 tal를 증폭시킨 후, 증폭한 tktA, cbbT2과 tal 유전자를 각각 발현 벡터 pBBR1MCS-3에 구축하여 재조합 플라스미드 pWL1-TKT, pWL1-CBBT2, pWL1-TAL를 얻었다. 전기 천공법을 통하여 플라스미드를 각각 W50-EAB에 형질전환시켜 재조합 균주 W50-KAB, W50-CAB과 W50-TAB을 얻었다. 유전자 녹아웃 기법을 이용하여 알데히드환원효소(aldehyde reductase) 유전자 h16_A3186의 녹아웃 균주 W50'-EAB를 얻었다. 전기 천공법을 통하여, 재조합 플라스미드 pWL1-TAL를 녹아웃 균주 W50'-EAB에 도입시켜 재조합 균주 W50'-TAB을 얻었다. 진탕 플라스크에서의 발효를 통하여 재조합 균주 W50-KAB, W50-CAB, W50-TAB, W50'-EAB 및 W50'-TAB의 발효 특성을 연구하였다. 【결과】효소 활성에 대한 분석은 트랜스케톨라제와 트랜스알돌라아제 유전자가 발현되었다는 것을 설명한다. 진탕 플라스크에서의 발효를 통하여, 트랜스케톨라제 유전자 과발현 균주 W50-KAB 및 W50-CAB이 대조균주 W50-EAB/p3에 비해, 자일로오스 이용 능력이 저하되었다는 것을 알 수 있었다. 그러나 트랜스알돌라아제 유전자 과발현 재조합 균주 W50-TAB 및 녹아웃 균주 W50'-EAB의 자일로오스 이용 수준은 어느 정도 향상되었다. 0.1 mol/L 자일로오스 발효 배지에서 W50-EAB의 최대 비성장 속도는 0.035 h -1 , PHB의 건중비(dry weight ratio)는 16.2±1.01%였다. 그러나 W50-TAB의 최대 비성장 속도는 0.039 h -1 으로 향상되었으며, PHB의 건중비는 20.5±0.76%에 달하였다. 알데히드환원효소 유전자 녹아웃 균주 W50'-EAB의 최대 비성장 속도는 0.040 h -1 으로 향상되었으며, PHB 함량은 19.8±1.05%으로 향상되었다. 연구 결과, 트랜스알돌라아제 유전자의 과발현과 알데히드환원효소 유전자의 녹아웃은 자일로오스 이용에 대하여 어느 정도의 우위를 나타냈다. 해당 두 가지 우위를 조합하여 균주 W50'-TAB을 얻은 후, 진탕 플라스크에서의 발효를 분석한 결과, 최대 비성장 속도는 0.042 h -1 , PHB 축적은 27.9±0.47%으로, 대조균주에 비해 72.2% 향상되었다. 이밖에, 글루코오스(0.01 mol/L)와 자일로오스(0.09 mol/L)로 구성된 혼합당에서 배양하였을 때, 재조합 균주 W50-TAB, W50'-EAB 및 W50'-TAB은 순수한 자일로오스에서 배양하였을 때에 비해 바이오매스와 세포내 PHB 축적량이 더 높았다. 【결론】펜토스인산(pentose phosphate) 경로의 핵심 효소인 트랜스알돌라아제 유전자의 과발현은 자일로오스 대사흐름의 가속화를 통하여, 자일로오스를 효과적으로 이용하고 어느 정도의 PHB를 축적하였다. 알데히드환원효소는 자일로오스 대사를 억제하였으며, 해당 유전자를 녹아웃하였을 때 자일로오스 대사가 어느 정도 향상되었다. 그러나 두가지 시너지 효과는 재조합 균주의 자일로오스 이용 효율과 PHB 축적 능력을 더 한층 향상시킬 수 있다. |
