| 초록 |
${ beta}$ -1,3-glucanase는 다양한 바이오공정에 널리 사용되어지는 효소로서 산업적 이용가치 증대를 위해 ${ beta}$ -1,3-glucanase의 대량생산이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 반복서열 ${ delta}$ -sequence에 의한 integration를 통해 Aspergillus oryzae유래의 ${ beta}$ -1,3-glucanase (EXGA)의 과발현 유도를 연구하였다. 먼저 효모내의 여러 염색체상에 EXGA 유전자를 integration하기 위해 $pRS{ delta}K$ -exgA와 $pRS{ delta}K$ -exgA 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 유전자의 구성적 발현을 위한 ADH1 프로모터, 분비생산을 위한 signal sequence와 ${ beta}$ -1,3-glucanase유전자의 integration을 위한 ${ delta}$ -sequence를 포함하고 있다. 먼저 $pRS{ delta}K$ -exgA 플라스미드를 $BY4742{ Delta}exg1$ 균주에 형질전환하고, 재조합 ${ beta}$ -1.3-glucanase가 안정하게 과발현 및 분비생산됨을 확인하였다. 다음으로 geneticin 선별을 통한 integration 유도와 ${ beta}$ -1,3-glucanase 활성과의 관계를 조사해보기 위해 $pRS{ delta}K$ -exgA 플라스미드를 $BY4742{ Delta}exg1$ (YKY082) 균주에 도입한 결과, geneticin 농도 증가에 따라 ${ beta}$ -1,3-glucanase 활성도 증가되었고, geneticin 농도 0.8 mg/ml가 ${ beta}$ -1,3-glucanase과발현에 적합한 농도임을 확인 할 수 있었다. 이어서 $pRS{ delta}K$ -exgA 플라스미드는 연속적 ${ delta}$ -integration에 의해 효모세포 내에 도입되어, 한번, 두번, 세번 그리고 네번의 integration에 의해 ${ beta}$ -1,3-glucanase의 비활성은 0.063, 0.095, 0.131 그리고 0.165 unit/ml/ $OD_{600}$ 로 증가되었다. 또한 연속적 integration에 의해 ${ beta}$ -1,3-glucanase의 활성이 증가됨에 따라 다양한 염색체에 도입된 EXGA 유전자의 복제수(integration 빈도)도 같이 증가되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 반복적 ${ delta}$ -sequence integration방법을 통해 재조합 ${ beta}$ -1,3-glucanase의 활성을 점진적으로 안정하게 증가시킬 수 있음을 제시하였다. |
